PRINSIP DASAR ELISA

ELISA adalah suatu metoda immunokimia yang berdasarkan reaksi spesifik antara antigen dengan antibodi yang memiliki sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi dengan menggunakan enzim sebagai indikatornya. Dengan memiliki satu dari komponen tersebut (antigen atau antibodi) yang dilabel dengan enzim dan diikatkan dengan pendukung immunosorbent, maka akan terbentuk antigen-antibodi kompleks. Pada metoda ELISA dengan antigen kompetitif, antibodi dilapiskan pada immunosorbent (substrat padat). Kemudian antigen sampel dan antigen yang berlabel enzim dimasukan kedalam immunosorbent sehingga terjadi kompetisi antara antigen sampel dengan antigen berlabel enzim untuk berikatan dengan antibodi dan terbentuk kompleks antibodi-antigen. Dengan tambahan substrat yang spesifik terhadap kerja enzim, akan dihasilkan reaksi yang menghasilkan warna. Hasil warna tersebut dapat dilihat secara visual atau diukur dengan menggunakan kolorimeter atau spektrofotometer. Ciri utama metoda ini adalah menggunakan suatu indikator enzim untuk reaksi immunologi (Burgess, 1995).
Teknik pengujian dengan metoda ELISA dapat dilakukan dengan beberapa konfigurasi, pemilihan konfigurasi tergantung dari besar molekul yang akan dideteksi, serta tingkat sensitifitas dan spesifitas yang dikehendaki. Beberapa konfigurasi tersebut adalah:
A. ELISA Kompetitif
ELISA Kompetitif dapat dibedakan menjadi dua, yaitu:
1. ELISA kompetitif langsung
Konfigurasi ELISA langsung merupakan konfigurasi paling sederhana. Antibodi spesifik dilapiskan pada mikroplat yang kemudian diinkubasi selama waktu tertentu. Analat yang akan dideteksi bersama dengan enzim-hapten konjugat ditambahkan pada mikroplat yang telah dilapisi dengan antibodi. Analat dan enzim-hapten konjugat akan saling berkompetisi untuk mengikat antibodi yang dilekatkan pada permukaan mikroplat. Banyaknya enzim-hapten konjugat yang dapat mengikat antibodi dapat ditentukan dengan penambahan substrat senyawa pembentuk warna. Warna yang terbentuk akan berbanding terbalik dengan jumlah analat yang terdeteksi dalam contoh. Semakin banyak analat dalam contoh maka analat mempunyai kesempatan yang lebih besar untuk mengikat antibodi, sehingga akan lebih sedikit enzim-hapten konjugat yang mengikat antibodi. Akibatnya intensitas warna yang terbentuk berkurang karena enzim yang bereaksi dengan substrat juga lebih sedikit.
2. ELISA kompetitif tak langsung
Pada metoda ini menunjukan bahwa warna yang ditimbulkan tidak langsung disebabkan oleh antigen dan antibodi yang bereaksi. Dibutuhkan suatu antibodi antispesies yang dilabel dengan enzim. Antigen dalam hal ini hapten protein konjugat dilekatkan pada permukaan mikroplat dan kemudian diinkubasi selama waktu tertentu. Analit bersama dengan antibodi ditambahkan kedalam mikroplat. Antigen dan analat akan berkompetisi untuk mengikat antibodi yang ada. Makin banyak analat dalam contoh yang diuji maka semakin sedikit antigen yang dapat mengikat antibodi. Sehingga antibodi kedua yang berlabel enzim (antibodi antispesies) yang ditambahkan jumlahnya akan semakin sedikit, akibatnya intensitas warna yang ditimbulkan juga semakin rendah.
Kompetitif ELISA merupakan konfigurasi yang banyak digunakan untuk pengujian cemaran, toksin serta senyawa dengan berat molekul kecil.

B. ELISA on-kompetitive sandwich
Antibodi dilekatkan pada permukaan sumur-sumur mikroplat, kemudian antigen dan contoh uji ditambahkan dan diinkubasi selama waktu tertentu. Kemudian ditambahkan antibodi kedua yang diberi label enzim. Intensitas warna yang ditimbulkan setelah penambahan substrat berbanding lurus dengan antigen yang terdeteksi. Konfigurasi ini digunakan untuk mendeteksi makromolekul atau senyawa dengan molekul besar seperti protein dan mikroorganisme. Akan tetapi kurang sensitif untuk mendeteksi senyawa dengan berat molekul kecil seperti toksin dan cemar